سانتریفیوژ دیفرانسیل اجازه می دهد تا سلول ها به کسری جدا شوند. سانتریفیوژ دیفرانسیل، انجماد روش سانتریفیوژ جداسازی دیفرانسیل

سخنرانی شماره 3.

تعداد ساعت: 2

روش های مطالعه سلولی

1. میکروسکوپ نوری

2. میکروسکوپ الکترونی، صمزایا و معایب. انواع میکروسکوپ الکترونی

سلول ها از نظر اندازه بسیار کوچک و در عین حال ساختار پیچیده ای دارند. بنابراین برای مطالعه موفقیت آمیز ساختار و عملکرد یک سلول، شناخت و تسلط بر روش های تجربی مناسب ضروری است.

در مرحله اول توسعه سیتولوژی، تنها راه مطالعه سلول ها بود میکروسکوپ نوری.

میکروسکوپدستگاهی است که به شما امکان می دهد از اشیاء کوچکی که با چشم غیرمسلح قابل رویت نیستند، تصویر بزرگنمایی به دست آورید. واحدهای طول زیر معمولاً در میکروسکوپ استفاده می شوند:

میکرومتر (1 میکرومتر – 10-6 متر)؛

نانومتر (1 نانومتر – 10-9 متر)؛

آنگستروم (1Å – 10-10 متر).

میکروسکوپ نوری و الکترونی وجود دارد. میکروسکوپ نوری از نور برای تولید تصویر بزرگ‌نمایی شده استفاده می‌کند، در حالی که میکروسکوپ الکترونی از جریانی از الکترون‌ها استفاده می‌کند. کیفیت تصویر با وضوح میکروسکوپ تعیین می شود. وضوح کوچکترین فاصله ای است که در آن اپتیک میکروسکوپ می تواند دو نقطه نزدیک به هم را به طور جداگانه تشخیص دهد. وضوحچشم انسان حدود 100 میکرون است. این بدان معناست که با چشم غیرمسلح، در فاصله 25 سانتی متری، ناظری با حدت بینایی متوسط می تواند یک نقطه را از نقطه دیگر در صورتی که حداقل 100 میکرومتر از هم جدا شوند، تشخیص دهد. اگر نقاط مورد نظر کمتر از 100 میکرومتر از هم فاصله داشته باشند، به نظر می رسد که یک نقطه تار هستند. بهترین میکروسکوپ نوری مدرن امکان بررسی ساختارهایی با فاصله بین عناصر حدود 0.25 میکرون، میکروسکوپ الکترونی - حدود 1.5 A را امکان پذیر می کند.

میکروسکوپ نوری مجموعه ای از روش ها برای مشاهده ریز اجسام با استفاده از میکروسکوپ های نوری مختلف است. این روش ها به طور قابل توجهی به نوع عدسی میکروسکوپ، دستگاه های کمکی آن، نوع میکرو جسم و روش آماده سازی آن برای مشاهده و همچنین به ماهیت روشنایی آن در حین مشاهده بستگی دارد. وضوح یک میکروسکوپ نوری با ابعاد قابل مقایسه با طول موج نور (0.4-0.7 میکرومتر برای نور مرئی) محدود می شود. با این حال، بسیاری از عناصر ساختار سلولی از نظر اندازه بسیار کوچکتر هستند. علاوه بر این، هنگام استفاده از یک میکروسکوپ نوری معمولی، اکثر ساختارهای یک سلول زنده هستند از نظر نوری خالیساختارهای خالی نوری آنهایی هستند که شفاف هستند و تقریباً از نظر ضریب شکست با محیط اطراف خود تفاوتی ندارند. روش های مختلفی برای شناسایی چنین سازه هایی ایجاد شده است. تثبیتو رنگ آمیزیمواد

تثبیتدرمانی است که به سرعت فرآیندهای حیاتی سلول را قطع می کند و تا آنجا که ممکن است ساختار سلول ها و بافت ها را بدون تغییر حفظ می کند. پس از تثبیت، سلول ها نسبت به رنگ ها نفوذپذیر می شوند، محل ثابت می شود و ساختار ماکرومولکول ها تثبیت می شود.

رنگ آمیزیبرای تمایز نوری ساختارهای سلولی و همچنین در مطالعات سیتوشیمیایی برای شناسایی محلی سازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شود. به عنوان مثال، رنگ های بازی (هماتوکسیلین) میل ترکیبی با محتویات هسته ای دارند، در حالی که رنگ های اسیدی (ائوزین) سیتوپلاسم را رنگ آمیزی می کنند. برای مطالعه سلول های زنده استفاده می شود رنگهای حیاتی (طول عمر).. رنگ های حیاتی نسبتاً آسان به سلول های زنده نفوذ می کنند و برخی از ساختارها را بدون آسیب رساندن به آنها لکه دار می کنند. با این حال، رنگ های حیاتی برای سلول کاملاً بی ضرر نیستند و پس از قرار گرفتن در معرض طولانی مدت منجر به مرگ آن می شوند. رنگهای حیاتی شامل قرمز خنثی(برای رنگ آمیزی سیتوپلاسم)، متیلن بلو(رنگ آمیزی مجتمع گلژی) و غیره با استفاده از رنگ های حیاتی می توان وجود برخی اندامک های سلولی را که قبلاً با مصنوعات اشتباه گرفته می شد، اثبات کرد.

غیرواقعی، ساختگی- تغییری که در طول تهیه دارو رخ می دهد.

قبل از آزمایش، سلول ها یا تکه های بافت معمولاً در پارافین مذاب یا یک رزین مخصوص ریخته می شوند. محیط مورد استفاده برای ریخته گری سرد یا پلیمریزه می شود. این منجر به یک بلوک جامد می شود که با استفاده از میکروتوم به بخش های بسیار نازک بریده می شود. به طور معمول، ضخامت مقاطع برای میکروسکوپ نوری 1-10 میکرومتر است. عیب این روش آسیب به تعدادی از ساختارهای سلولی است. بنابراین از روش تهیه مقاطع با استفاده از انجماد سریع استفاده می شود. بافت منجمد بر روی یک میکروتوم مخصوص (کرایوتوم) مجهز به محفظه سرد (کرایوستات) بریده می شود.

علاوه بر میکروسکوپ نوری معمولی، سلول ها با استفاده از میدان تاریک، کنتراست فاز، فلورسانس و برخی دیگر از انواع میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار می گیرند.

میکروسکوپ میدان تاریک برخلاف میکروسکوپ معمولی، یک میکروسکوپ میدان تاریک به یک کندانسور مخصوص مجهز است. کندانسور دارای یک دیافراگم تیره است که نور را به مرکز میدان دید منتقل نمی کند، به طوری که جسم توسط یک پرتو مایل روشن می شود. در این حالت فقط پرتوهای منعکس شده و پراکنده شده از سطح جسم وارد عدسی میکروسکوپ می شود که کنتراست برخی از ساختارها را افزایش داده و آنها را قابل مشاهده می کند. میکروسکوپ میدان تاریک برای مشاهده تعدادی از ساختارها در یک سلول زنده استفاده می شود. به طور خاص، میکروسکوپ میدان تاریک برای تعیین فراوانی آسیب آکروزوم در سلول های اسپرم حیوانات مزرعه استفاده می شود.

میکروسکوپ کنتراست فاز میکروسکوپ کنتراست فاز توسط Fritz Zernike در سال 1932 طراحی شد. میکروسکوپ فاز کنتراست یک روش عالی برای مشاهده داخل حیاتی سلول ها است. برای مطالعه بسیاری از اندامک ها و کروموزوم های سلولی در طول تقسیم استفاده می شود. کندانسور میکروسکوپ کنتراست فاز دارای یک دیافراگم حلقوی است که نور به شکل مخروطی توخالی از آن عبور می کند و پرتوهای باقی مانده جذب می شوند. لنز شامل یک صفحه فاز است که یک دیسک شفاف با یک بریدگی است. شکل و اندازه بریدگی با تصویر مستقیم دیافراگم حلقوی مطابقت دارد. هنگامی که جسمی بین کندانسور و عدسی در صفحه کانونی عقب لنز قرار می گیرد، علاوه بر تصویر مستقیم، چندین تصویر پراش دیافراگم همپوشانی ظاهر می شود. بریدگی صفحه فاز به گونه ای محاسبه می شود که هر دو پرتو پرتوهای تشکیل دهنده تصاویر مستقیم و پراش در طول مسیر نوری به اندازه یک چهارم طول موج متفاوت هستند. بنابراین، اختلاف فازهایی که قبلاً برای چشم نامرئی بودند، به اختلاف شدت تبدیل می شوند و قابل مشاهده می شوند.

میکروسکوپ فلورسانس روش خوبی برای مشاهده سلول های داخل حیاتی است. میکروسکوپ فلورسانس به شما امکان می دهد فلورسانس (درخشش) تعدادی از مواد و ساختارهای سلولی را مشاهده کنید. فلورسانس یک جسم توسط پرتوهای فرابنفش یا آبی-بنفش از منابع نور خاص برانگیخته می شود. تابش یک جسم همیشه طول موج بیشتری نسبت به نور هیجان انگیز دارد. جسم در پرتوهای فلورسانس خود مشاهده می شود که با استفاده از فیلترهای نوری از پرتوهای نور هیجان انگیز جدا می شود. تعدادی از مواد (برخی ویتامین ها، رنگدانه ها، لیپیدها) فلورسانس (اولیه) خاص خود را دارند. مواد سلولی که این خاصیت را ندارند با رنگ های مخصوص از قبل رنگ آمیزی می شوند - فلوروکروم ها، و سپس فلورسانس ثانویه مشاهده می شود.

میکروسکوپ الکترونی. یک میکروسکوپ الکترونی از جریانی از الکترون ها در خلاء به جای نور برای ایجاد تصویر استفاده می کند. پرتو الکترونی مانند یک میکروسکوپ نوری توسط عدسی ها متمرکز نمی شود، بلکه توسط میدان های الکترومغناطیسی متمرکز می شود. تصویر بر روی یک صفحه فلورسنت مشاهده شده و عکس گرفته شده است. اجسام در حین میکروسکوپ الکترونی در خلاء عمیق هستند، بنابراین ابتدا تحت تثبیت و درمان ویژه قرار می گیرند. به همین دلیل، تنها سلول های کشته شده را می توان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی بررسی کرد. علاوه بر این، آنها باید بسیار نازک باشند، زیرا جریان الکترون ها به شدت توسط جسم جذب می شود. در این راستا از مقاطع فوق نازک با ضخامت 50-20 نانومتر که بر روی نازک ترین لایه ها قرار می گیرند به عنوان اجسام استفاده می شود. که در میکروسکوپ الکترونی عبوری (انتقالی).الکترون ها از یک جسم به همان طریقی عبور می کنند که نور در میکروسکوپ نوری از آن عبور می کند. میکروسکوپ الکترونی عبوری برای مطالعه بخش های بسیار نازک میکروب ها، بافت ها و همچنین ساختار اجسام کوچک (ویروس ها، تاژک ها و غیره) استفاده می شود. که در میکروسکوپ الکترونی روبشییک پرتو متمرکز دقیق از الکترون ها در سراسر سطح نمونه به جلو و عقب حرکت می کند. در این حالت الکترون های منعکس شده از سطح آن جمع آوری شده و تصویری را تشکیل می دهند. مزیت استفاده از این نوع میکروسکوپ الکترونی این است که تصویری سه بعدی ایجاد می کند. بنابراین از میکروسکوپ الکترونی روبشی برای مطالعه سطح اجسام استفاده می شود. یک میکروسکوپ الکترونی دارای قدرت تفکیک 1-2 نانومتر است. این برای مطالعه ماکرومولکول ها کافی است.

اتورادیوگرافی. این روش مبتنی بر استفاده از موادی است که با ایزوتوپ های رادیواکتیو برچسب گذاری شده اند. اگر یک ایزوتوپ رادیواکتیو که در طی متابولیسم توسط سلول‌ها جذب می‌شود به محیط اضافه شود، مکان‌یابی درون سلولی آن می‌تواند متعاقباً با استفاده از اتورادیوگرافی شناسایی شود. با این روش، بخش های نازکی از سلول ها روی فیلم قرار می گیرند. فیلم زیر آن مکان هایی که ایزوتوپ های رادیواکتیو در آن قرار دارند تیره می شود. فسفر به عنوان ایزوتوپ استفاده می شود ( P 32)، آهن (Fe 59)، گوگرد (S 35 کربن (C 14)، تریتیوم ( H 3) و غیره

سانتریفیوژ. این روش در سال 1926 آغاز شد، زمانی که Svedberg یک سانتریفیوژ تحلیلی اختراع کرد و از آن برای تعیین وزن مولکولی هموگلوبین استفاده کرد. قبل از سانتریفیوژ، لازم است غشای سلولی از بین برود. تخریب با استفاده از ارتعاش اولتراسونیک، شوک اسمزی، سنگ زنی و فشار دادن از طریق یک سوراخ کوچک انجام می شود. با تخریب دقیق، برخی از اندامک های سلولی دست نخورده باقی می مانند. بافت های خرد شده با غشای سلولی تخریب شده در لوله های آزمایش قرار می گیرند و با سرعت بالا در سانتریفیوژ می چرخند. این روش بر این واقعیت استوار است که اندامک های سلولی مختلف جرم و چگالی متفاوتی دارند. اندامک‌های متراکم‌تر در یک لوله آزمایش در سرعت‌های سانتریفیوژ پایین و آنهایی که متراکم‌تر هستند - در سرعت‌های بالا قرار می‌گیرند. این لایه ها به طور جداگانه مورد مطالعه قرار می گیرند. بنابراین، هسته ها و سلول های تخریب نشده به سرعت با سرعت های نسبتا کم ته نشین می شوند و رسوبی در انتهای لوله سانتریفیوژ تشکیل می دهند. در سرعت‌های بالاتر، میتوکندری‌ها رسوب می‌کنند و در سرعت‌های بالاتر و دوره‌های سانتریفیوژ طولانی‌تر، ریبوزوم‌ها رسوب می‌کنند. به طور معمول، چنین اجزای خالص شده فعالیت بیوشیمیایی بالایی را حفظ می کنند.

روش کشت سلولی و بافتی شامل این واقعیت است که از یک یا چند سلول روی یک محیط غذایی خاص می توان گروهی از سلول های یک نوع را به دست آورد. این روش نه تنها برای سیتولوژی، بلکه برای پزشکی و کشاورزی نیز چشم اندازهای زیادی دارد. بنابراین، از کشت سلولی برای شفاف سازی الگوهای تمایز، تعامل سلول ها با محیط، سازگاری، پیری، تبدیل و غیره استفاده می شود. در بیوتکنولوژی از کشت سلولی در تولید واکسن ها و مواد فعال بیولوژیکی استفاده می شود. در فارماکولوژی، آنها به عنوان اشیاء آزمایشی هنگام آزمایش داروهای جدید استفاده می شوند. بنیانگذار این روش جانورشناس و جنین شناس آمریکایی R. Garrison (1879-1959) است که در سال 1907 موفق به پرورش سلول های سمندر در محیطی مصنوعی خارج از بدن شد. پس از آن، بسیاری از انواع سلول های گیاهی و حیوانی رشد کردنددرونکشتگاهی و این روش به ما اجازه داد تا تعدادی اکتشاف مهم در زمینه فیزیولوژی سلولی انجام دهیم. اصطلاحدرونکشتگاهی (لاتین به معنای "در شیشه") به این معنی است که تحقیقات نه بر روی یک موجود زنده، بلکه در یک ظرف شیشه ای از یک نوع یا دیگری انجام شده است. برخلاف عبارت اول in vivo نشان دهنده آزمایشی با یک موجود زنده کامل است. کشت هایی که مستقیماً از بافت های بدن تهیه می شوند نامیده می شوند محصولات اولیهدر بیشتر موارد، سلول های کشت اولیه را می توان از ظرف کشت منتقل کرد و برای تولید مقادیر زیادی استفاده کرد محصولات ثانویهاز خطوط سلولی می توان برای تولید کلون هایی استفاده کرد که از یک سلول پیش ساز منفرد مشتق شده اند. می تواند انجام شود همجوشی سلولییک یا انواع مختلف برای دستیابی به همجوشی، سلول ها در معرض آنزیم های ویروسی یا پلی اتیلن گلیکول قرار می گیرند. این مواد به غشای پلاسمایی سلول ها آسیب می رسانند و در نتیجه سلولی با دو هسته مجزا ایجاد می شود. پس از مدتی مشخص، چنین سلولی با میتوز تقسیم می شود و یک سلول هیبریدی تشکیل می دهد. در یک سلول هیبریدی، همه کروموزوم ها در یک هسته بزرگ ترکیب می شوند. چنین سلول های هیبریدی را می توان برای تولید یک رده سلولی هیبریدی کلون کرد. با استفاده از این روش می توان سلول های هیبریدی انسان و موش، انسان و وزغ را به دست آورد. سلول های هیبرید حاصل ناپایدار هستند و پس از تقسیمات سلولی متعدد، اکثر کروموزوم های یکی از انواع دیگر را از دست می دهند. محصول نهایی، برای مثال، اساساً به یک سلول موشی تبدیل می‌شود که هیچ یا فقط مقدار کمی از ژن‌های انسانی موجود است. بنابراین، می توان از این تکنیک برای نقشه برداری ژن ها در کروموزوم های انسانی با موفقیت استفاده کرد.

میکروسرجری.این روش مبتنی بر استفاده از میکرومانیپلاتورها است. آنها وسایلی هستند که حرکات دقیق ریزابزارها را در قفس ارائه می کنند. ابزارهای میکرو معمولاً از شیشه ساخته می شوند. شکل آنها توسط وظایف عملیات میکروسکوپی تعیین می شود. می توانند به صورت سوزن، سرنگ، پیپت، کاردک، چاقوی جراحی و ... باشند که با استفاده از میکرومانیپولاتورها می توان عملیات مختلفی را روی سلول ها انجام داد (تزریق مواد به داخل سلول، استخراج و پیوند هسته، آسیب موضعی به ساختارهای سلولی و ...). عمل جراحی میکروسکوپی به ویژه بر روی سلول های بزرگ (سلول های تک سلولی، تخم دوزیستان، سلول های جنینی برخی از حیوانات) خوب عمل می کند. بنابراین سلول آمیب را می توان به سه جزء اصلی تقسیم کرد - غشاء، سیتوپلاسم و هسته. سپس می توان این اجزا را دوباره جمع کرد و یک سلول زنده را تشکیل داد. به این ترتیب می توان سلول های مصنوعی متشکل از اجزای انواع آمیب را به دست آورد. جراحی های میکروسکوپی نه تنها با میکرو ابزار، بلکه با پرتو متمرکز پرتوهای فرابنفش (تزریق میکرو پرتو) انجام می شود.

علاوه بر روش های فوق، از کروماتوگرافی، الکتروفورز و برخی روش های دیگر برای مطالعه سلول ها استفاده می شود. روش های جدید پیشرفت های زیادی در مطالعه سلول ها داشته اند. با این حال، باید به خاطر داشت که روش‌های کلاسیک سیتولوژی، مبتنی بر تثبیت، رنگ‌آمیزی و مطالعه سلول‌ها در زیر میکروسکوپ نوری، هنوز اهمیت عملی خود را حفظ کرده‌اند.

سخنرانی 1.

ساختار سلول گیاهی

میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ الکترونی

سانتریفیوژ دیفرانسیل

روش کشت سلولی

سلول واحد اصلی ساختاری و عملکردی موجودات زنده است.

سلول ها جنینیبافت های (غیر تخصصی) حیوانات و گیاهان از نظر ساختاری بسیار شبیه به هم هستند. این شرایط بود که زمانی دلیل پیدایش و توسعه نظریه سلولی بود. تفاوت های مورفولوژیکی قبلاً در سلول های تمایز یافته بافت های تخصصی گیاهان و حیوانات ظاهر می شود. ویژگی های ساختاری یک سلول گیاهی، مانند گیاهان به طور کلی، با سبک زندگی و تغذیه مرتبط است. اکثر گیاهان یک سبک زندگی نسبتاً بی حرکت (پیوسته) دارند. ويژگي تغذيه گياه در اين است كه آب و مواد غذايي : آلي و معدني در اطراف پراكنده شده و گياه بايد آنها را با انتشار جذب كند. علاوه بر این، گیاهان سبز در نور یک روش اتوتروفیک تغذیه را انجام می دهند. به لطف این، برخی از ویژگی های خاص ساختار و رشد سلول های گیاهی تکامل یافته است. این شامل:

	بادوام دیواره سلولی پلی ساکارید، سلول را احاطه کرده و یک قاب سفت و سخت می سازد.
	سیستم پلاستید ، که در ارتباط با نوع تغذیه اتوتروف به وجود آمد.
	سیستم واکوئلی که در سلول های بالغ معمولاً با یک واکوئل مرکزی بزرگ نشان داده می شود که تا 95٪ از حجم سلول را اشغال می کند و نقش مهمی در حفظ آن ایفا می کند. فشار تورگر;
	نوع خاصی از رشد سلولی توسط رگ به رگ شدن(به دلیل افزایش حجم واکوئل)؛
	تمام توان یعنی امکان بازسازی یک گیاه کامل از یک سلول گیاهی تمایز یافته.
	یک جزئیات دیگر وجود دارد که سلول های گیاهی را از سلول های حیوانی متمایز می کند: در گیاهان، در طول تقسیم سلولی، آنها بیان نمی شوند. سانتریول ها.

ساختار یک سلول در کلی ترین شکل آن از درس زیست شناسی عمومی برای شما شناخته شده است و در آمادگی برای کنکور این مبحث را به خوبی مطالعه کرده اید. این موضوع نیز از جنبه های مختلف در دروس دانشگاهی مربوطه (مثلا جانورشناسی بی مهرگان، گیاهان پست) مورد بحث قرار می گیرد. علاوه بر این، آشنایی دقیق تر با سلول در سطح بالا در دوره "سیتولوژی" خواهد بود. برای ما مهم است که بر ویژگی های ساختاری خاص یک سلول گیاهی، عمدتاً سلول های یک گیاه بالاتر تمرکز کنیم.

یک بررسی بسیار سطحی از ساختار یک سلول گیاهی معمولی سه جزء اصلی را نشان می دهد: (1) دیواره سلولی، (2) یک واکوئل که یک موقعیت مرکزی در سلول های بالغ را اشغال می کند و تقریباً کل حجم آنها را پر می کند و (3) پروتوپلاست، توسط واکوئل به شکل یک لایه دیواره به محیط رانده می شود. این اجزا هستند که با بزرگنمایی کم میکروسکوپ نوری شناسایی می شوند. علاوه بر این، غشای سلولی و واکوئل محصول فعالیت حیاتی پروتوپلاست هستند.

بدن سلول زنده؟ پروتوپلاست از اندامک های غوطه ور در آن تشکیل شده است هیالوپلاسم. موجودات سلولی عبارتند از: هسته، پلاستیدها، میتوکندری ها، دیکتوزوم ها، شبکه آندوپلاسمی، میکروبادی ها و غیره. هیالوپلاسم با اندامک های منهای هسته است. سیتوپلاسمسلول ها.

برای بیان اندازه ساختارهای درون سلولی، از معیارهای طول خاصی استفاده می شود: میکرومترو نانومتر.

میکرومتر در سیستم SI واحدهای اندازه گیری مقداری برابر با 10 -6 متر است . به عبارت دیگر، میکرومتر (مخفف میکرومتر) 1/1000000 متر و 1/1000 میلی متر است. 1 میکرومتر = 10-6 متر . نام قدیمی این پیمانه میکرون.

یک نانومتر در همان سیستم نشان دهنده یک میلیونیم میلی متر 1 نانومتر = 10-9 متر است. و یک هزارم میکرومتر.

اندازه و شکل سلول های گیاهی بسیار متفاوت است. به طور معمول، اندازه سلول های گیاهان عالی بین 10 تا 300 میکرون است. درست است، سلول های غول پیکر وجود دارد، به عنوان مثال، سلول های پالپ آبدار مرکبات چندین میلی متر قطر دارند، یا الیاف بسیار بلند گزنه به طول 80 میلی متر با ضخامت میکروسکوپی می رسند.

آنها از نظر شکل متمایز می شوند ایزودیمتریکسلول هایی که ابعاد خطی آنها در همه جهات برابر است یا کمی متفاوت است (یعنی طول، عرض و ارتفاع این سلول ها قابل مقایسه هستند). به چنین سلول هایی پارانشیمی می گویند (پارانشیم).

سلول های به شدت کشیده که طول آنها چندین برابر (گاهی اوقات صدها و هزاران) بیشتر از ارتفاع و عرض است، پروسانشیمی نامیده می شود. (پروسانشیم).

روش های مطالعه سلول های گیاهی

روش های زیادی برای مطالعه سلول ها توسعه یافته و مورد استفاده قرار گرفته است که قابلیت های آنها میزان دانش ما را در این زمینه مشخص می کند. پیشرفت‌ها در مطالعه زیست‌شناسی سلولی، از جمله برجسته‌ترین دستاوردهای سال‌های اخیر، معمولاً با استفاده از روش‌های جدید همراه است. بنابراین، برای درک کاملتر زیست شناسی سلولی، لازم است حداقل درک درستی از روش های مناسب برای مطالعه سلول ها داشته باشیم.

میکروسکوپ نوری

قدیمی ترین و در عین حال رایج ترین روش مطالعه سلول ها میکروسکوپ است. می توان گفت که آغاز مطالعه سلول ها با اختراع میکروسکوپ نوری نوری آغاز شد.

وضوح چشم غیرمسلح انسان حدود 1/10 میلی متر است. این بدان معنی است که اگر به دو خط با فاصله کمتر از 0.1 میلی متر از هم نگاه کنید، آنها در یک خط ادغام می شوند. برای تمایز بیشتر ساختارهایی که قرار گرفته اند، از ابزارهای نوری مانند میکروسکوپ استفاده می شود.

اما امکانات یک میکروسکوپ نوری بی حد و حصر نیست. حد تفکیک یک میکروسکوپ نوری با طول موج نور تعیین می شود، یعنی می توان از میکروسکوپ نوری فقط برای مطالعه سازه هایی استفاده کرد که حداقل ابعاد آنها با طول موج تابش نور قابل مقایسه است. بهترین میکروسکوپ نوری دارای قدرت تفکیک حدود 0.2 میکرون (یا 200 نانومتر) است که حدود 500 برابر بهتر از چشم انسان است. از نظر تئوری ساخت میکروسکوپ نوری با وضوح بالا غیرممکن است.

بسیاری از اجزای سلول از نظر چگالی نوری مشابه هستند و بدون درمان خاص، عملاً در میکروسکوپ نوری معمولی نامرئی هستند. به منظور قابل مشاهده بودن آنها، متنوع است رنگ هابا گزینش خاصی

در آغاز قرن نوزدهم. نیاز به رنگ برای رنگرزی پارچه های نساجی وجود داشت که به نوبه خود باعث رشد سریع شیمی آلی شد. مشخص شد که برخی از این رنگ‌ها بافت‌های بیولوژیکی را نیز لکه‌دار می‌کنند و به‌طور غیرمنتظره، اغلب ترجیحاً به اجزای خاصی از سلول متصل می‌شوند. استفاده از چنین رنگ های انتخابی امکان مطالعه دقیق تر ساختار داخلی سلول را فراهم می کند. در اینجا فقط چند نمونه آورده شده است:

	رنگ هماتوکسیلینبرخی از اجزای هسته را آبی یا بنفش رنگ می کند.
	پس از پردازش متوالی فلوروگلوسینولو سپس با اسید هیدروکلریک، غشای سلولی lignified تبدیل به قرمز گیلاس می شود.
	رنگ سودان IIIغشاهای سلولی زیر پوست را صورتی رنگ می کند.
	محلول ضعیف ید در یدید پتاسیم دانه های نشاسته را آبی می کند.

برای بررسی میکروسکوپی اکثر بافت ها قبل از رنگ آمیزی ثابت. پس از تثبیت، سلول ها نسبت به رنگ ها نفوذپذیر می شوند و ساختار سلول تثبیت می شود. یکی از رایج ترین فیکساتورها در گیاه شناسی اتیل الکل است.

تثبیت و رنگ آمیزی تنها روش های مورد استفاده برای آماده سازی آماده سازی نیست. اکثر بافت ها خیلی ضخیم هستند که نمی توان فوراً در وضوح بالا مشاهده کرد. بنابراین، مقاطع نازک بر روی انجام می شود میکروتوم. این دستگاه از اصل برش نان استفاده می کند. بافت های گیاهی به بخش های کمی ضخیم تر از بافت های حیوانی بریده می شوند زیرا سلول های گیاهی معمولاً بزرگتر هستند. ضخامت مقاطع بافت گیاهی برای میکروسکوپ نوری حدود 10 میکرون - 20 میکرون است. برخی از بافت ها خیلی نرم هستند و نمی توان آنها را بلافاصله برش داد. بنابراین، پس از تثبیت، آنها را داخل پارافین مذاب یا رزین مخصوص می ریزند که کل پارچه را اشباع می کند. پس از خنک شدن، یک بلوک جامد تشکیل می شود که سپس با استفاده از میکروتوم برش داده می شود. درست است، پر کردن برای بافت های گیاهی بسیار کمتر از حیوانات استفاده می شود. این با این واقعیت توضیح داده می شود که سلول های گیاهی دارای دیواره های سلولی قوی هستند که قاب بافت را تشکیل می دهند. پوسته های لگن شده به ویژه قوی هستند.

با این حال، ریختن می تواند ساختار سلول را مختل کند، بنابراین از روش دیگری استفاده می شود که این خطر کاهش می یابد؟ انجماد سریع در اینجا می توانید بدون تعمیر و پر کردن انجام دهید. بافت منجمد با استفاده از میکروتوم مخصوص بریده می شود (کرایوتوم).

مقاطع منجمد تهیه شده به این روش دارای مزیت متمایز حفظ بهتر ویژگی های ساختاری طبیعی هستند. با این حال، پختن آنها دشوارتر است و وجود کریستال های یخ هنوز برخی از جزئیات را خراب می کند.

میکروسکوپیست ها همیشه نگران احتمال از بین رفتن و اعوجاج برخی از اجزای سلول در طی فرآیند تثبیت و رنگ آمیزی بوده اند. بنابراین، نتایج به دست آمده با روش های دیگر تایید می شود.

فرصتی برای بررسی سلول‌های زنده در زیر میکروسکوپ، اما به گونه‌ای که جزئیات ساختار آنها واضح‌تر ظاهر شود، بسیار وسوسه‌انگیز به نظر می‌رسید. این فرصت توسط سیستم های نوری ویژه فراهم شده است: کنتراست فازو دخالتمیکروسکوپ ها به خوبی شناخته شده است که امواج نور، مانند امواج آب، می توانند با یکدیگر تداخل داشته باشند و دامنه امواج حاصل را افزایش یا کاهش دهند. در یک میکروسکوپ معمولی، هنگامی که امواج نور از اجزای منفرد یک سلول عبور می کنند، فاز خود را تغییر می دهند، اگرچه چشم انسان نمی تواند این تفاوت ها را تشخیص دهد. اما به دلیل تداخل، امواج را می توان تبدیل کرد و سپس اجزای مختلف سلول را می توان در زیر میکروسکوپ بدون استفاده از رنگ آمیزی از یکدیگر تشخیص داد. این میکروسکوپ ها از 2 پرتو امواج نوری استفاده می کنند که بر یکدیگر اثر متقابل دارند (سوپرپوز) و دامنه امواج ورودی از اجزای مختلف سلول را به چشم افزایش یا کاهش می دهند.

میکروسکوپ الکترونی

قابلیت های یک میکروسکوپ نوری، همانطور که قبلا ذکر شد، توسط طول موج نور مرئی محدود می شود. حداکثر وضوح آن تقریباً 0.2 میکرون است.

پیشرفت بزرگی در میکروسکوپ در دهه 1920 انجام شد، زمانی که کشف شد که میدان های الکترومغناطیسی مناسب انتخاب شده را می توان مانند عدسی ها برای متمرکز کردن پرتوهای الکترونی استفاده کرد.

طول موج یک الکترون بسیار کوتاهتر از طول موج نور مرئی است و اگر به جای نور از الکترون استفاده شود، حد تفکیک میکروسکوپ به میزان قابل توجهی کاهش می یابد.

بر اساس همه اینها، میکروسکوپی ساخته شد که در آن به جای نور از پرتوی الکترون استفاده شده است. اولین میکروسکوپ الکترونی در سال 1931 توسط Knoll و Ruska در آلمان ساخته شد. با این حال، سال ها گذشت تا اینکه امکان مطالعه برش های بافت با استفاده از این میکروسکوپ فراهم شد. تنها در دهه 50 بود که روش هایی برای تولید بخش هایی با کیفیت های لازم توسعه یافت. از آن زمان، عصر جدیدی از میکروسکوپ آغاز شد و جریانی از اطلاعات در مورد ساختار ظریف سلول ها به معنای واقعی کلمه به علم سرازیر شد. (فراساختار سلولی).

مشکلات میکروسکوپ الکترونی این است که پردازش ویژه آماده سازی برای مطالعه نمونه های بیولوژیکی ضروری است.

اولین مشکل این است که الکترون ها قدرت نفوذ بسیار محدودی دارند، بنابراین بخش های فوق نازک با ضخامت 50 تا 100 نانومتر باید آماده شوند. برای به دست آوردن چنین بخش های نازکی، ابتدا بافت را با رزین آغشته می کنند: رزین پلیمریزه می شود و یک بلوک پلاستیکی سخت را تشکیل می دهد. سپس با استفاده از یک چاقوی تیز شیشه ای یا الماسی، برش ها را روی میکروتوم مخصوص برش می دهند.

مشکل دیگری وجود دارد: وقتی الکترون ها از بافت بیولوژیکی عبور می کنند، تصویر کنتراست به دست نمی آید. برای به دست آوردن کنتراست، مقاطع نازک نمونه های بیولوژیکی با نمک های فلزات سنگین آغشته می شوند.

دو نوع اصلی میکروسکوپ الکترونی وجود دارد. که در انتقالمیکروسکوپ (انتقال)، پرتوی از الکترون ها، با عبور از یک نمونه مخصوص آماده شده، تصویر خود را بر روی صفحه نمایش می گذارد. وضوح یک میکروسکوپ الکترونی عبوری مدرن تقریباً 400 برابر بیشتر از وضوح نور است. وضوح این میکروسکوپ ها حدود 0.5 نانومتر است (برای مقایسه، قطر اتم هیدروژن حدود 0.1 نانومتر است).

با وجود چنین وضوح بالایی، میکروسکوپ های الکترونی عبوری دارای معایب عمده ای هستند:

یک تصویر سه بعدی (حجمی) با استفاده از اسکن کردنمیکروسکوپ الکترونی (EM). در اینجا پرتو از نمونه عبور نمی کند، بلکه از سطح آن منعکس می شود.

آیا نمونه آزمایش ثابت و خشک می شود و سپس با یک لایه نازک فلز پوشانده می شود؟ عملیات نامیده می شود سایه زدن(نمونه سایه دار است).

در اسکن EM، یک پرتو الکترونی متمرکز به یک نمونه هدایت می شود (نمونه اسکن می شود). در نتیجه سطح فلز نمونه الکترون های ثانویه با انرژی کم ساطع می کند. آنها ضبط می شوند و روی صفحه تلویزیون به تصویر تبدیل می شوند. حداکثر وضوح یک میکروسکوپ روبشی کوچک است، حدود 10 نانومتر، اما تصویر سه بعدی است.

روش فریز تراشه

احتمالات اساساً جدید میکروسکوپ الکترونی نسبتاً اخیراً پس از توسعه روش باز شده است. "انجماد - خرد کردن".با استفاده از این روش، ریزترین جزئیات ساختار سلول بررسی می شود و تصویری سه بعدی در میکروسکوپ الکترونی عبوری به دست می آید.

در طی انجماد معمولی، کریستال های یخ در سلول ها تشکیل می شوند که به طرز محسوسی ساختار آنها را مخدوش می کنند. برای جلوگیری از این امر، سلول‌ها به سرعت در دمای نیتروژن مایع (-196 C) منجمد می‌شوند. با چنین انجماد فوری، کریستال های یخ زمان تشکیل را ندارند و سلول تغییر شکل را تجربه نمی کند.

بلوک یخ زده با تیغه چاقو تقسیم می شود (از این رو نام روش). سپس معمولاً در یک محفظه خلاء، یخ اضافی با تصعید خارج می شود. این عملیات نامیده می شود حکاکی کردنپس از اچ، برجستگی در صفحه برش به وضوح مشخص می شود. نمونه دریافت کرد سایه دار،یعنی لایه نازکی از فلزات سنگین بر روی سطح نمونه پاشیده می شود. با این حال، ترفند این است که رسوب گذاری با زاویه ای نسبت به سطح نمونه انجام می شود. این نکته بسیار مهمی است. یک افکت سایه ظاهر می شود و تصویر سه بعدی به نظر می رسد.

در یک میکروسکوپ انتقالی، پرتو الکترونی فقط می تواند در بخش های بسیار نازک نفوذ کند. ضخامت معمول نمونه های سایه دار بیش از حد است، بنابراین مواد آلی زیر لایه فلزی باید حل شود. نتیجه یک فلز نازک است المثنی، کپی دقیق(یا حک) از سطح نمونه. ماکت در میکروسکوپ انتقال استفاده می شود.

این روش، برای مثال، فرصتی منحصر به فرد برای مشاهده ساختار داخلی غشای سلولی فراهم کرد.

سانتریفیوژ دیفرانسیل

علاوه بر میکروسکوپ، روش اصلی و گسترده دیگر برای مطالعه سلول ها است سانتریفیوژ دیفرانسیلیا تقسیم بندی

اصل روش این است که در حین سانتریفیوژ یک نیروی گریز از مرکز ایجاد می شود که تحت تأثیر آن ذرات معلق در انتهای لوله سانتریفیوژ قرار می گیرند.

با معرفی اولتراسانتریفیوژ در اوایل دهه 1940، جداسازی اجزای سلولی امکان پذیر شد.

قبل از قرار دادن سلول ها در معرض سانتریفیوژ، آنها باید از بین بروند - قاب سفت و سخت غشای سلولی باید از بین برود. برای انجام این کار از روش‌های مختلفی استفاده می‌شود: ارتعاش اولتراسونیک، فشار دادن از طریق سوراخ‌های کوچک، یا رایج‌ترین آسیاب کردن بافت‌های گیاهی با یک پاستول در ملات چینی. با استفاده دقیق از روش های تخریب، برخی از اندامک ها را می توان دست نخورده حفظ کرد.

در طول سانتریفیوژ با سرعت بالا، اجزای سلولی بزرگ (مانند هسته ها) به سرعت با سرعت های نسبتا کم ته نشین می شوند (رسوب) و رسوبی در انتهای لوله سانتریفیوژ تشکیل می دهند. با سرعت بالاتر، اجزای کوچکتر مانند کلروپلاست و میتوکندری رسوب می کنند.

یعنی در طول سانتریفیوژ، اجزای سلول به بخش‌های بزرگ و کوچک تقسیم می‌شوند، به همین دلیل نام دوم روش است؟ تقسیم بندی علاوه بر این، هر چه سرعت و مدت سانتریفیوژ بیشتر باشد، کسر حاصل ریزتر می شود.

میزان ته نشینی (رسوب) اجزا با استفاده از آن بیان می شود ضریب رسوب،تعیین شده است اس.

مراحل سانتریفیوژ افتراقی: سرعت کم (هسته، اسکلت سلولی)، سرعت متوسط (کلروپلاست)، سرعت بالا (میتوکندری، ریزوزوم، میکروبادی)، سرعت بسیار بالا (ریبوزوم).

عصاره های سلولی تکه تکه شده که سیستم های بدون سلول نیز نامیده می شوند، به طور گسترده برای مطالعه فرآیندهای درون سلولی استفاده می شوند. تنها با کار با عصاره های بدون سلول می توان مکانیسم مولکولی دقیق فرآیندهای بیولوژیکی را ایجاد کرد. بنابراین، استفاده از این روش خاص موفقیت پیروزمندانه ای را در مطالعه بیوسنتز پروتئین به ارمغان آورد.

خوب، به طور کلی، بخش های خالص ساختارهای درون سلولی را می توان تحت هر نوع تجزیه و تحلیل قرار داد.

روش کشت سلولی

سلول های حیوانی جدا شده در کشت (یعنی قرار داده شده بر روی یک محیط غذایی) پس از تعداد معینی از تقسیم ها می میرند و بنابراین یک شی دشوار و نامناسب برای کشت به حساب می آیند. چیز دیگر سلول های گیاهی است که می توانند تعداد نامحدودی تقسیم شوند.

روش کشت سلولی مطالعه مکانیسم های تمایز سلولی در گیاهان را تسهیل می کند.

در یک محیط غذایی، آیا سلول های گیاهی یک توده سلولی تمایز نیافته همگن تشکیل می دهند؟ پینه.پینه با هورمون درمان می شود. تحت تأثیر هورمون ها، سلول های پینه می توانند اندام های مختلفی را ایجاد کنند.

ساختار و عملکرد یک سلول گیاهی.

1. ساختار یک سلول گیاهی: غشای سلولزی، غشای پلاسمایی، سیتوپلاسم با اندامک، هسته، واکوئل با شیره سلولی. وجود پلاستیدها ویژگی اصلی یک سلول گیاهی است.

2. عملکرد غشای سلولی - به سلول شکل آن را می دهد، از آن در برابر عوامل محیطی محافظت می کند.

3. غشای پلاسما یک فیلم نازک است، متشکل از مولکول های متقابل لیپیدها و پروتئین ها است، محتویات داخلی را از محیط خارجی محدود می کند، انتقال آب، مواد معدنی و مواد آلی را به داخل سلول با اسمز و انتقال فعال تضمین می کند و همچنین حذف می کند. مواد زائد مضر

4. سیتوپلاسم محیط نیمه مایع داخلی سلول است که هسته و اندامک ها در آن قرار دارند و ارتباط بین آنها را فراهم می کند و در فرآیندهای اساسی زندگی شرکت می کند.

5. شبکه آندوپلاسمی - شبکه ای از کانال های انشعاب در سیتوپلاسم. در سنتز پروتئین ها، لیپیدها و کربوهیدرات ها و در انتقال مواد نقش دارد. ریبوزوم ها اجسامی هستند که در ER یا در سیتوپلاسم قرار دارند و از RNA و پروتئین تشکیل شده اند و در سنتز پروتئین نقش دارند. EPS و ریبوزوم ها یک دستگاه واحد برای سنتز و انتقال پروتئین ها هستند.

6. میتوکندری اندامک هایی هستند که با دو غشاء از سیتوپلاسم محدود شده اند. در آنها با مشارکت آنزیم ها، مواد آلی اکسید شده و مولکول های ATP سنتز می شوند. افزایش سطح غشای داخلی که آنزیم ها روی آن قرار دارند به دلیل کریستا. ATP یک ماده آلی غنی از انرژی است.

7. پلاستیدها (کلروپلاست، لوکوپلست، کروموپلاست)، محتوای آنها در سلول ویژگی اصلی موجودات گیاهی است. کلروپلاست ها پلاستیدهای حاوی رنگدانه سبز کلروفیل هستند که انرژی نور را جذب می کند و از آن برای سنتز مواد آلی از دی اکسید کربن و آب استفاده می کند. کلروپلاست ها توسط دو غشاء از سیتوپلاسم جدا می شوند، خروجی های متعدد - گرانا در غشای داخلی، که در آن مولکول ها و آنزیم های کلروفیل قرار دارند.

8. کمپلکس گلژی سیستمی از حفره هایی است که با یک غشاء از سیتوپلاسم محدود شده اند. تجمع پروتئین ها، چربی ها و کربوهیدرات ها در آنها. انجام سنتز چربی ها و کربوهیدرات ها بر روی غشاها.

9. لیزوزوم ها اجسامی هستند که با یک غشاء از سیتوپلاسم جدا شده اند. آنزیم های موجود در آنها تجزیه مولکول های پیچیده به مولکول های ساده را تسریع می کنند: پروتئین ها به اسیدهای آمینه، کربوهیدرات های پیچیده به ساده، لیپیدها به گلیسرول و اسیدهای چرب، و همچنین قسمت های مرده سلول و کل سلول ها را از بین می برند.

10. واکوئل ها - حفره هایی در سیتوپلاسم پر از شیره سلولی، محل تجمع مواد مغذی ذخیره و مواد مضر. آنها محتوای آب را در سلول تنظیم می کنند.

11. اجزاء سلولی - قطره ها و دانه های مواد مغذی ذخیره (پروتئین ها، چربی ها و کربوهیدرات ها).

12. هسته قسمت اصلی سلول است که از بیرون با یک غشای هسته ای دو غشایی که با منافذ نفوذ کرده است پوشیده شده است. مواد وارد هسته می شوند و از طریق منافذ از آن خارج می شوند. کروموزوم ها حامل اطلاعات ارثی در مورد ویژگی های یک موجود زنده هستند، ساختارهای اصلی هسته، که هر کدام از یک مولکول DNA ترکیب شده با پروتئین ها تشکیل شده است. هسته محل سنتز DNA، mRNA و rRNA است.

سانتریفیوژ چیست؟ روش مورد استفاده برای چیست؟ اصطلاح "سانتریفیوژ" به معنای جداسازی ذرات مایع یا جامد یک ماده به بخش های مختلف با استفاده از نیروهای گریز از مرکز است. این جداسازی مواد از طریق استفاده از دستگاه های ویژه - سانتریفیوژها انجام می شود. اصل روش چیست؟

اصل سانتریفیوژ

بیایید با جزئیات بیشتری به تعریف نگاه کنیم. سانتریفیوژ اثر بر روی مواد از طریق چرخش با سرعت فوق العاده بالا در یک دستگاه تخصصی است. بخش اصلی هر سانتریفیوژ روتور است که شامل لانه هایی برای نصب لوله های آزمایش با موادی است که در معرض جداسازی به بخش های جداگانه هستند. هنگامی که روتور با سرعت بالا می چرخد، مواد قرار داده شده در لوله های آزمایش با توجه به سطح چگالی به مواد مختلف جدا می شوند. برای مثال، سانتریفیوژ کردن نمونه‌های آب زیرزمینی، مایع را جدا کرده و ذرات جامد موجود در آن را رسوب می‌دهد.

نویسنده روش

برای اولین بار پس از آزمایشات انجام شده توسط دانشمند A.F. Lebedev مشخص شد که سانتریفیوژ چیست. این روش توسط یک محقق برای تعیین ترکیب آب خاک توسعه یافته است. قبلاً برای این منظور از ته نشینی مایع با جداسازی بعدی نمونه های جامد از آن استفاده می شد. توسعه روش سانتریفیوژ باعث شد تا بتوان با این کار بسیار سریعتر کنار آمد. به لطف این جداسازی، استخراج بخش جامد مواد از مایع به شکل خشک در عرض چند دقیقه امکان پذیر شد.

مراحل سانتریفیوژ

سانتریفیوژ دیفرانسیل با ته نشین شدن موادی که در معرض تحقیق هستند آغاز می شود. این پردازش مواد در دستگاه های ته نشینی رخ می دهد. در هنگام ته نشین شدن، ذرات ماده تحت تأثیر گرانش از هم جدا می شوند. این به شما امکان می دهد با استفاده از نیروهای گریز از مرکز مواد را برای جداسازی بهتر آماده کنید.

در مرحله بعد، مواد موجود در لوله های آزمایش تحت فیلتراسیون قرار می گیرند. در این مرحله از درام های به اصطلاح سوراخ دار استفاده می شود که برای جداسازی ذرات مایع از جامد در نظر گرفته شده است. در طول فعالیت های ارائه شده، تمام رسوبات بر روی دیواره های سانتریفیوژ باقی می ماند.

مزایای روش

در مقایسه با روش‌های دیگر با هدف جداسازی مواد منفرد، مانند فیلتراسیون یا ته نشینی، سانتریفیوژ به دست آوردن رسوبی با حداقل رطوبت ممکن می‌شود. استفاده از این روش جداسازی امکان جداسازی سوسپانسیون های ریز را فراهم می کند. نتیجه تولید ذرات با اندازه 5-10 میکرون است. یکی دیگر از مزایای مهم سانتریفیوژ امکان انجام آن با استفاده از تجهیزات با حجم و ابعاد کوچک است. تنها عیب روش مصرف بالای انرژی دستگاه هاست.

سانتریفیوژ در زیست شناسی

در زیست شناسی، جداسازی مواد به مواد جداگانه زمانی انجام می شود که آماده سازی آماده سازی برای بررسی زیر میکروسکوپ ضروری باشد. سانتریفیوژ در اینجا با استفاده از دستگاه های پیچیده - سیتوروتورها انجام می شود. این دستگاه‌ها علاوه بر شکاف‌های لوله‌های آزمایش، مجهز به نگهدارنده‌های نمونه و انواع اسلایدهای پیچیده هستند. طراحی سانتریفیوژ هنگام انجام تحقیقات در زیست شناسی به طور مستقیم بر کیفیت مواد به دست آمده و بر این اساس، مقدار اطلاعات مفیدی که از نتایج تجزیه و تحلیل به دست می آید تأثیر می گذارد.

سانتریفیوژ در صنعت پالایش نفت

روش سانتریفیوژ در تولید روغن ضروری است. مواد معدنی هیدروکربنی وجود دارد که آب به طور کامل از آنها در طول تقطیر آزاد نمی شود. سانتریفیوژ کردن باعث می شود تا مایع اضافی از روغن خارج شود و کیفیت آن افزایش یابد. در این حالت روغن در بنزن حل می شود و سپس تا دمای 60 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود و سپس تحت نیروی گریز از مرکز قرار می گیرد. در نهایت مقدار آب باقیمانده در ماده را اندازه بگیرید و در صورت لزوم این روش را تکرار کنید.

سانتریفیوژ خون

این روش به طور گسترده برای اهداف دارویی استفاده می شود. در پزشکی، به شما امکان می دهد تعدادی از مشکلات زیر را حل کنید:

گرفتن نمونه خون خالص برای پلاسمافرزیس. برای این منظور، عناصر تشکیل شده خون از پلاسمای آن در یک سانتریفیوژ جدا می شوند. این عمل باعث می شود خون از شر ویروس ها، آنتی بادی های اضافی، باکتری های بیماری زا و سموم خلاص شود.
آماده سازی خون برای انتقال خون اهداکننده پس از اینکه مایع بدن توسط سانتریفیوژ به بخش‌های جداگانه جدا شد، سلول‌های خونی به اهداکننده بازگردانده می‌شوند و پلاسما برای انتقال خون استفاده می‌شود یا برای استفاده بعدی منجمد می‌شود.
جداسازی توده پلاکتی این ماده از توده حاصل به دست می آید و در بخش های جراحی و هماتولوژی موسسات پزشکی، درمان اورژانس و اتاق های عمل استفاده می شود. استفاده از توده پلاکتی در پزشکی، بهبود لخته شدن خون در قربانیان را ممکن می سازد.
سنتز گلبول های قرمز. سانتریفیوژ سلول‌های خونی از طریق جداسازی ظریف بخش‌های آن طبق یک تکنیک خاص انجام می‌شود. توده تمام شده، غنی از گلبول های قرمز خون، برای انتقال خون در هنگام از دست دادن خون و عملیات استفاده می شود. گلبول های قرمز اغلب برای درمان کم خونی و سایر بیماری های سیستمیک خون استفاده می شود.

در عمل پزشکی مدرن، بسیاری از دستگاه های نسل جدید استفاده می شود که این امکان را فراهم می کند که یک درام چرخان را به سرعت معینی شتاب داده و آن را در یک لحظه خاص متوقف کنید. این اجازه می دهد تا خون با دقت بیشتری به گلبول های قرمز، پلاکت ها، پلاسما، سرم و لخته ها تقسیم شود. سایر مایعات بدن نیز به روشی مشابه بررسی می شوند، به ویژه، مواد موجود در ادرار جدا می شوند.

سانتریفیوژها: انواع اصلی

ما فهمیدیم که سانتریفیوژ چیست. حال بیایید دریابیم که از چه دستگاه هایی برای پیاده سازی روش استفاده می شود. سانتریفیوژها می توانند بسته یا باز، مکانیکی یا دستی باشند. قسمت کار اصلی ابزارهای باز دستی یک محور چرخشی است که به صورت عمودی قرار دارد. در قسمت بالایی آن یک میله عمود بر ثابت وجود دارد که آستین های فلزی متحرک در آن قرار دارند. آنها حاوی لوله های آزمایش ویژه ای هستند که در پایین باریک می شوند. پشم پنبه در پایین آستین ها قرار می گیرد که از آسیب دیدن لوله آزمایش شیشه ای در تماس با فلز جلوگیری می کند. سپس دستگاه به حرکت در می آید. پس از مدتی مایع از جامدات معلق جدا می شود. پس از این، سانتریفیوژ دستی متوقف می شود. یک رسوب متراکم و جامد در انتهای لوله های آزمایش متمرکز می شود. بالای آن قسمت مایع ماده است.

سانتریفیوژهای مکانیکی نوع بسته دارای تعداد زیادی آستین برای قرار دادن لوله های آزمایش هستند. چنین دستگاه هایی در مقایسه با دستگاه های دستی راحت تر هستند. روتورهای آنها توسط موتورهای الکتریکی قدرتمند به حرکت در می آیند و می توانند تا 3000 دور در دقیقه شتاب بگیرند. این امکان جداسازی بهتر مواد مایع از جامد را فراهم می کند.

ویژگی های آماده سازی لوله ها برای سانتریفیوژ

لوله های آزمایشی که برای سانتریفیوژ استفاده می شوند باید با مواد آزمایشی با جرم یکسان پر شوند. بنابراین در اینجا از ترازوهای با دقت بالا برای اندازه گیری استفاده می شود. هنگامی که لازم است چندین لوله در یک سانتریفیوژ متعادل شود، از تکنیک زیر استفاده می شود. پس از وزن کردن یک جفت ظرف شیشه ای و به دست آوردن جرم یکسان، یکی از آنها به عنوان استاندارد باقی می ماند. لوله های بعدی قبل از قرار گرفتن در دستگاه با این نمونه متعادل می شوند. این تکنیک در مواقعی که لازم است یک سری لوله کامل برای سانتریفیوژ آماده شود، کار را به طور قابل توجهی سرعت می بخشد.

شایان ذکر است که مقدار زیادی از ماده آزمایش هرگز در لوله های آزمایش قرار نمی گیرد. ظروف شیشه ای به گونه ای پر می شوند که فاصله تا لبه حداقل 10 میلی متر باشد. در غیر این صورت، ماده تحت تأثیر نیروی گریز از مرکز از لوله آزمایش خارج می شود.

سوپرسانتریفیوژها

برای جداسازی اجزای سیستم تعلیق بسیار نازک، استفاده از سانتریفیوژهای دستی یا مکانیکی معمولی کافی نیست. در این مورد، تأثیر چشمگیرتری بر مواد حاصل از نیروهای گریز از مرکز مورد نیاز است. هنگام اجرای چنین فرآیندهایی، از سوپرسانتریفیوژها استفاده می شود.

دستگاه های طرح ارائه شده مجهز به یک درام کور به شکل یک لوله با قطر کوچک - حداکثر 240 میلی متر است. طول چنین درام به طور قابل توجهی از سطح مقطع آن فراتر می رود، که باعث می شود تعداد دورها به میزان قابل توجهی افزایش یابد و یک نیروی گریز از مرکز قدرتمند ایجاد شود.

در یک سوپرسانتریفیوژ، ماده مورد آزمایش وارد درام می شود، از طریق لوله حرکت می کند و با بازتابنده های مخصوص برخورد می کند که مواد را روی دیواره های دستگاه پرتاب می کند. همچنین محفظه هایی برای حذف جداگانه مایعات سبک و سنگین طراحی شده است.

مزایای سوپرسانتریفیوژها عبارتند از:

سفتی مطلق؛
بیشترین شدت جداسازی مواد؛
ابعاد فشرده؛
توانایی جداسازی مواد در سطح مولکولی.

سرانجام

بنابراین ما متوجه شدیم که سانتریفیوژ چیست. در حال حاضر، این روش زمانی کاربرد خود را پیدا می کند که جداسازی رسوبات از محلول ها، تصفیه مایعات و جداسازی اجزای مواد فعال بیولوژیکی و شیمیایی ضروری باشد. اولتراسانتریفیوژها برای جداسازی مواد در سطح مولکولی استفاده می شوند. روش سانتریفیوژ به طور فعال در صنایع شیمیایی، نفت، هسته ای، مواد غذایی و همچنین در پزشکی استفاده می شود.

Leibig (Zig. به گفته S. Granik، 1962) ثابت کرد که در بافت های مریستمی آهن برای سنتز آنزیم های حاوی آهن میتوکندری ضروری است. 82 درصد آن در کلروپلاست ها متمرکز شده است و تنها آثاری در هسته ها یافت می شود. در همین زمان، ع.ف. آگافونوا، N.S. Chaplygina (1962)، با مطالعه جذب آهن توسط گیاهان و توزیع آن در داخل سلول، به این نتیجه رسید که هسته های سلولی پارانشیم برگ های ذرت حاوی آهن بیشتری نسبت به کلروپلاست ها و ساختارهای نوع میتوکندری هستند. محتوای آهن در دومی کمتر از کلروپلاست بود.
کار J. Skok (1962) برخی از داده ها را در مورد محلی سازی بور در ساختارهای سلولی ارائه می دهد. نویسنده اشاره می کند که میتوکندری ها و میکروزوم ها حاوی بور کمتری نسبت به هسته ها، پلاستیدها و مایع رویی هستند. برای انجام عملکردهای مختلف سلولی، از بور موجود در بخش دیالیز شده رویی استفاده می شود.
ما به اتفاق ز.م. کلیموویتسکایا، L.D. Leydenskaya و E.V. روداکوا در 1961-1953. محل یابی عناصر کمیاب منگنز، مولیبدن و روی در ساختارهای سلولی گیاهان، و همچنین محتوای عناصر کمیاب در ارتباط با انتوژنز گیاه را مورد مطالعه قرار داد. از روش سانتریفیوژ افتراقی استفاده شد که امکان جداسازی سیتوپلاسم و اندامک های سلول را فراهم می کند: هسته، کلروپلاست، میتوکندری. ما روشی را برای جداسازی ساختارهای سلولی پیشنهاد شده توسط N.S دنبال کردیم. سیساکیان، آی.م. موسولووا (1961-1962).
در سال 1961، کار در یک سانتریفیوژ یخچالی با وضوح کلی 30000 گرم انجام شد. قطعات بزرگی از سلول ها از هموژنه های برگ چغندرقند (واریته Verkhnyachskaya 020) در محلول ساکارز 0.35 مولار در 2500 گرم، کلروپلاست در 4500 گرم و میتوکندری در 17000 گرم جدا شد. کسری های جدا شده سوزانده شدند. منگنز در خاکستر حاصل تعیین شد. محتوای آن بر حسب یک کسر خاص جدا شده از 1 کیلوگرم ماده خام گیاهی بر حسب میلی گرم بیان شد. بنابراین، قطعات سلول بزرگ حاوی 20.88 میلی گرم بر کیلوگرم منگنز، یا 44.5٪. در کلروپلاست - 3.46 یا 7.5؛ در میتوکندری - 2.05 یا 4.3؛ در ساختارهای سیتوپلاسمی غیر سبز - 20.43 میلی گرم بر کیلوگرم یا 43.7٪. آماده سازی کلروپلاست با لومینسانس مشخصه آنها شناسایی شد.
بیشترین مقدار منگنز در ساختارهای سیتوپلاسمی غیرسبز و قطعات سلولی بزرگ وجود داشت. هنگام محاسبه مجدد محتوای منگنز در خاکستر هر بخش، حداکثر مقدار آن برای بخش کلروپلاست و میتوکندری ذکر شد. قطعات سلولی بزرگ حاوی 325.1 میلی گرم منگنز در 100 گرم خاکستر یا 16.3 درصد بود. در کلروپلاست - 823.9 یا 42.5؛ در میتوکندری - 500 یا 25.1؛ در ساختارهای سیتوپلاسمی غیر سبز - 321 میلی گرم یا 16.1٪ منگنز.
در سال 1962، روش زیر را برای مطالعه محتوای منگنز، مولیبدن و روی در ساختارهای سلولی برگ‌های باقلا و چغندرقند اتخاذ کردیم. لوبیا (واریته Herz-Freya) و چغندر قند (واریته Ramonskaya 04) در ایستگاه مزرعه آزمایشی مؤسسه فیزیولوژی گیاهی آکادمی علوم اوکراین SSR بر روی خاک پودزولیزه علفزار-چرنوزمیک با توجه به پس زمینه NPK با افزودن منگنز، مولیبدن و روی. در ابتدا، وسط و پایان فصل رشد، نمونه‌هایی از برگ‌ها (30 گرم ماده خام) برداشتیم، سپس آنها را با 40 میلی‌لیتر ساکارز 0.5 مولار و 10 میلی‌لیتر بافر فسفات (طبق گفته سورنسن) روی یخ آسیاب کردیم. PH محیط 7.1 است. هموژن های به دست آمده تحت سانتریفیوژ افتراقی بر روی سانتریفیوژ TM-14 با وضوح 20000 گرم قرار گرفتند. ابتدا قطعات سلولی بزرگ از هموژنه ها حذف شدند. سپس قطعات کوچکتر سلولی در سانتریفیوژ 1500 و 3000 گرم به مدت 10 دقیقه جداسازی شدند. اشاره شد که در 3000 گرم، هسته ها در عرض 10 دقیقه ته نشین می شوند. کلروپلاست ها به مدت 15 دقیقه در 6000 - 10000 گرم و میتوکندری ها در 14000 گرم جداسازی شدند. فراکسیون های جدا شده با 2 میلی لیتر ساکارز به مدت 10-15 دقیقه با سرعت مناسب برای هر بخش تحت سانتریفیوژ مکرر قرار گرفتند. فراکسیون های به دست آمده در مافل سوزانده شدند و منگنز، مولیبدن و روی در خاکستر آنها تعیین شد. محتوای این ریز عناصر نیز در مایع رویی باقی مانده تعیین شد.
فراکسیون ها تحت آنالیز بافت شناسی قرار گرفتند. غشاهای سلولی، هسته ها و کلروپلاست ها زیر میکروسکوپ بررسی شدند. ما قادر به شناسایی میتوکندری نبودیم. برگهای لوبیا دارای عناصر شکل بسیار سنگینی بودند. اینها عمدتاً کلروپلاست بودند که تقریباً به طور کامل در 3000-6000 گرم رسوب کردند. مایع رویی شفاف بود. در چغندرقند، کلروپلاست ها به بهترین وجه در 6000-10000 گرم رسوب می شوند. حتی در 14000 گرم نیز نمی توان یک مایع رویی کاملا شفاف به دست آورد. این به وضوح فقدان یک روش واحد برای جداسازی ساختارهای سلولی را توضیح می دهد. درجات مختلف ته نشینی ساختارهای سلولی نیازمند روش های متمایز برای جداسازی آنها با در نظر گرفتن ویژگی های بیولوژیکی هر فرهنگ است.
مقدار ریز عناصر در ساختارهای سلولی جدا شده با سانتریفیوژ افتراقی بر حسب میلی گرم به ازای هر کیلوگرم ماده خام نمونه، به صورت درصدی از محتوای کل و بر حسب میلی گرم در 100 گرم خاکستر هر بخش محاسبه شد.
از ساختارهای سلولی برگ چغندرقند، حداکثر مقدار منگنز (در صورت محاسبه به ازای کسر جدا شده از 1 کیلوگرم ماده خام) در مایع رویی، یعنی در سیتوپلاسم متمرکز می شود. در قطعات سلولی بزرگ (کلروپلاست، هسته، میتوکندری) به ترتیب نزولی وجود دارد. در اواسط فصل رشد، مقدار منگنز در برگ چغندرقند (جدول 45) به دلیل افزایش محتوای آن در قطعات سلولی بزرگ و مایع رویی افزایش می یابد. در اندامک های سلولی (هسته، کلروپلاست، میتوکندری) در طول فصل رشد نسبتاً ثابت می ماند.

روش فریز تراشه

فرصت های اساسی جدید برای میکروسکوپ الکترونی نسبتاً اخیراً پس از توسعه روش "انجماد-شکاف" باز شده است. با استفاده از این روش، ریزترین جزئیات ساختار سلول بررسی می شود و تصویری سه بعدی در میکروسکوپ الکترونی عبوری به دست می آید.

در طی انجماد معمولی، کریستال های یخ در سلول ها تشکیل می شوند که به طرز محسوسی ساختار آنها را مخدوش می کنند. برای جلوگیری از این امر، سلول ها خیلی سریع در دمای نیتروژن مایع (196- درجه سانتیگراد) منجمد می شوند. با چنین انجماد فوری، کریستال های یخ زمان تشکیل را ندارند و سلول تغییر شکل را تجربه نمی کند.

بلوک یخ زده با تیغه چاقو تقسیم می شود (از این رو نام روش). سپس معمولاً در یک محفظه خلاء، یخ اضافی با تصعید خارج می شود. به این عمل اچینگ می گویند. پس از اچ، برجستگی در صفحه برش به وضوح مشخص می شود. نمونه به دست آمده سایه دار می شود، یعنی لایه نازکی از فلزات سنگین بر روی سطح نمونه پاشیده می شود. با این حال، ترفند این است که رسوب گذاری با زاویه ای نسبت به سطح نمونه انجام می شود. این نکته بسیار مهمی است. یک افکت سایه ظاهر می شود و تصویر سه بعدی به نظر می رسد.

در یک میکروسکوپ انتقالی، پرتو الکترونی فقط می تواند در بخش های بسیار نازک نفوذ کند. ضخامت معمول نمونه های سایه دار بیش از حد است، بنابراین مواد آلی زیر لایه فلزی باید حل شود. نتیجه یک ماکت فلزی نازک (یا نقش) از سطح نمونه است. ماکت در میکروسکوپ انتقال استفاده می شود.

این روش، برای مثال، فرصتی منحصر به فرد برای مشاهده ساختار داخلی غشای سلولی فراهم کرد.

سانتریفیوژ دیفرانسیل

علاوه بر میکروسکوپ، روش اصلی و پرکاربرد دیگر برای مطالعه سلول ها سانتریفیوژ افتراقی یا شکنش است.

با معرفی اولتراسانتریفیوژ در اوایل دهه 1940، جداسازی اجزای سلولی امکان پذیر شد.

میزان ته نشینی (رسوب) اجزا با استفاده از ضریب ته نشینی که S نشان داده می شود بیان می شود.

خوب، به طور کلی، بخش های خالص ساختارهای درون سلولی را می توان تحت هر نوع تجزیه و تحلیل قرار داد.

روش کشت سلولی

روش کشت سلولی مطالعه مکانیسم های تمایز سلولی در گیاهان را تسهیل می کند.

در یک محیط غذایی، سلول های گیاهی یک توده سلولی تمایز نیافته همگن - کالوس را تشکیل می دهند. پینه با هورمون درمان می شود. تحت تأثیر هورمون ها، سلول های پینه می توانند اندام های مختلفی را ایجاد کنند.